再生医学领域“潜力股”

　　作者：唐兵兵(天津工业大学材料工程专业研究生)

　　指导老师：刘延波(天津工业大学纺织学部高级工程师)

　　作者的话

　　生意社4月11日讯　丝素蛋白具有良好的生物相容性且来源广泛，然而纯丝素蛋白材料硬而脆，易断裂，可纺性差。而PVA是一种成本低廉的生物相容性聚合物，成膜性能好，具有良好的物理机械性能。本文使用了天津市卫生装备研究所提供的桑蚕丝、北京普博欣生物科技有限责任公司提供的透析袋。通过丝素蛋白与PVA的共混，能够改善丝素蛋白的缺陷，弥补其不足，并通过静电纺丝技术制得性能优良的纳米纤维材料。细且均匀的SF/PVA共混纳米纤维材料，在再生医学应用领域具有很大的潜在价值和前景。

　　实验操作得出关键数据

　　蚕丝主要是由丝胶和丝素蛋白两部分构成。丝素蛋白是蚕丝的主要部分，含量约占蚕丝的70%~80%，丝素蛋白分子以反平行折叠链(β-sheet)构象为基础，形成直径约为10nm的微纤维，无数纤维密切结合组成直径约为1μm的细纤维，约100根细纤维沿长轴排列，构成直径为10μm~18μm的单纤维，这种单纤维就是丝素蛋白纤维。丝素蛋白作为一种天然的蛋白纤维材料，含有人体所必需的氨基酸，对活体组织具有良好的生物相容性，对机体无毒性、无致敏和刺激作用，丝素蛋白可部分生物降解，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮肤、牙周组织等有营养与修复的作用。

　　SF/PVA共混静电纺纳米纤维作为组织工程支架，一方面由于电纺纳米纤维膜具有孔隙率高、长径比大、生物相容性好的优点，有利于细胞的粘附、迁移以及增值，指导细胞分化成熟细胞体；另一方面，神经、平滑肌血管内皮细胞、骨骼肌细胞等在组织的生长上具有方向性,控制细胞按照一定的方向生长对其分化具有非常重要的作用。在生物相容性纳米纤维材料用于组织工程支架的研究中，人们也发现纳米纤维的取向度对于细胞的吸附和增殖具有重要作用，即细胞倾向于沿着纳米纤维取向的方向生长。

　　实验操作得出关键数据

　　由于丝素蛋白分子具有高度有序的反平行β-折叠构象，并且两条相邻的β-折叠肽链的N-H和C=O间形成氢键，结构很稳定，因此丝素在一般条件下是难以溶解的，只有在酸碱或是高浓度的中性盐溶液中才能水解，然而用酸碱会使丝素的分子量降低，不利于纺丝，所以一般用高浓度的中性盐溶液来溶解丝素。本论文拟采用CaCl2-C2H5OH-H2O三元溶剂溶解丝素。

　　本实验流程是：蚕丝脱胶—丝素溶解—丝素溶液透析—丝素溶液浓缩—丝素溶液浓度测定。

　　原料与仪器

　　桑蚕丝若干(天津市卫生装备研究所提供)；碳酸钠、氯化钙、乙醇、聚乙二醇(PEG-20000，平均分子质量为18500g~22000g)(天津市科密欧化学试剂有限公司提供)；透析袋(规格为3500道尔顿，北京普博欣生物科技有限责任公司提供)。集热式恒温加热磁力搅拌器(型号DF-101S，巩义市英峪予华仪器厂提供)；高速大容量电动离心机(型号XJ-A)、电子天平(型号JA5003)和数显鼓风干燥箱(型号GZX-9070MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂提供)。

　　试样的制备

　　称取适量的桑蚕丝置于浓度为0.5%的碳酸钠溶液中，浴比为1︰50，在90℃~100℃的水浴锅中处理30min，并在此过程中不断搅拌，30min后取出用自来水冲洗干净，重复3次，前两次用自来水冲洗，第三次用去离子水冲洗。以脱去蚕丝中的丝胶。脱胶后洗净，用烘箱在60℃下烘干得到精炼蚕丝，并计算脱胶率。可以通过脱胶率的计算来估测丝胶脱去情况(注：蚕丝中丝素蛋白约占总重量的75%，丝胶约占25%，故脱胶率应在25%左右)。

　　离心后得到丝素蛋白与三元溶剂的混合溶液，但是丝素溶液分子中含有CaCl2、C2H5OH小分子，如若纺成纳米纤维膜用于组织工程材料，不仅会影响细胞的粘附，也会对细胞生长造成危害，降低其生物相容性，故必须设法把这些小分子去除，得到纯净的SF溶液。丝素蛋白属于大分子，故考虑用透析的办法，用一种膜能阻止丝素蛋白大分子通过却能让CaCl2等小分子通过。选择规格比较小的透析袋来透析纯化丝素蛋白溶液。

　　把规格为3500道尔顿的透析袋剪成20cm长的小段，根据丝素溶液的量剪取适当的段数，放入去离子水中浸泡几分钟，透析袋会慢慢变软胀开成筒状。把丝素蛋白溶液加入透析袋中，不要装的太满，装入量约占透析袋长度的1/2~2/3之间，装液量不要太多，以免透析过程中把透析袋胀破，丝素蛋白溶液流出。然后，把透析袋扎紧，放在流动的自来水中透析48h，之后用去离子水透析24h，并且需要每两个小时换一次水。透析后可用硝酸银溶液检验用于透析的水中是否有白色沉淀，无沉淀则得到纯的丝素蛋白溶液。

　　将透析过的丝素蛋白溶液连同透析袋直接放入40%的PEG-20000溶液中浓缩，PEG-20000溶液要能浸没透析袋，大约7~8小时后会浓缩到15%左右。此过程中要一直注意丝素蛋白溶液的浓缩程度，以免丝素蛋白溶液成膜。

　　取一定量浓缩后的丝素蛋白溶液，称取其质量，然后放在室温条件下自然干燥成膜，并称取膜的质量，因为丝素蛋白大分子不易挥发，可用膜的质量除以取得的丝素蛋白溶液的质量，来代替丝素蛋白溶液的浓度。

　　静电纺丝实验

　　静电纺丝试验装置如下图所示，即常见的针—板电极结构，实验溶液通过微量计量泵控制流速，经医用注射软管推入喷丝针管。交流变压器经整流后得到直流高压加于电极两端。

　　本实验中聚乙烯醇的浓度为8%。根据所需要的浓度，称取一定质量的聚乙烯醇(PVA)，加入蒸馏水中，放在磁力搅拌器中，温度设置在80℃，搅拌1h，直至完全溶解，制得所需浓度的PVA溶液。

　　将配比好的溶液充分溶解混合后加入20ml注射器中，用医用软管连接到喷丝针管，喷丝针头取21号针(外径0.82mm，内径0.52mm)、22号针(外径0.72mm，内径0.42mm)。将注射器固定于微量注射泵上，流量可用微量注射泵控制。将高压电源用电夹夹在针头处，接收极接地，本实验中电源电压范围在15kV~30kV。实验条件和参数如下表所示。

　　数据分析确定最佳工艺

　　在相同的接收距离、相同电压下，不同的溶液及配比的比较。取实验组A2、A5、B1、C1、D1、E1、F1、G1中样品研究如下。

　　如上图所示，比较A2和A5可以观察到，纯的SF溶液浓度为25%时，纺出的样品能够成丝，但是却有很多珠状液滴出现，当浓度提高到34%时，A5明显比A2纺出的丝的效果好，但仍有部分膜状结构粘连，可能是溶剂未挥发干净留下的。当丝素浓度较低时，丝素溶液具有较差的可纺性，这是因为纺丝液粘度小、分子链间作用力微弱、表面张力不够，并且此时纺丝液中溶剂含量大，挥发缓慢，所以在A2图中的样品出现了较多细小的珠状液滴，且纤维层间粘连严重，浓度增大有所改善，但还是有粘连。

　　比较A2和B1可以看出当在25%的SF溶液中加入PVA时，纺丝液的可纺性明显增加，A2中只是出现少许丝，大量的珠状液滴，B1中却出现了很多丝，而且丝比较均匀，虽然还是有部分珠状液滴。可见在纯的SF溶液中加入PVA能够改善SF溶液的可纺性，这是因为PVA具有很好的韧性，溶液粘度较大，加入SF溶液中，使SF溶液的粘度增加，分子链间作用力增强。

　　比较B1、C1、D1、E1可以看到SF/PVA的配比由90/10变化到50/50时，可纺性进一步改善。当PVA含量低时，喷丝还是比较困难，接收板上出现较多珠状液滴(如图C1、D1、E1)，提高PVA的含量后，共混纺丝液的可纺性增加，珠状液滴会逐渐减少。而近一步增加PVA的含量，又会出现珠状液滴。出现这一现象的原因是纺丝液中两组分的共混相容性所引起的。比较F1、G1，共混纺丝液纺出的丝中有珠状液滴，而纯的PVA丝却很均匀，很少有珠状液滴。

　　结论：SF溶液浓度增大，其可纺性增加；加入PVA后可纺性近一步增加，当配比为60/40左右时，效果最好。

　　静电纺丝过程中，喷丝针头处的液滴在高压静电力的作用下克服纺丝液表面张力，形成射流，在电场中运动变形，在电场力的作用下来拉伸，最终在接收板上形成纤维。因此，场强对纤维的形貌、分布、直径等都产生重要的影响。

　　对于实验用的针—板电极结构中，某一点的场强大小与针板之间所加的电压是紧密相关的，改变电压就能改变场强大小，从而影响射流受力情况。

　　对于一定流速的纺丝液，如果场强太小，无法克服表面张力，液滴就会慢慢在针尖处积累，最后在重力作用下掉下来，对于易挥发性的溶剂，则可能使溶剂在针尖处挥发，固化的溶质会堵住针口，它们都无法形成纤维。如果场强太大，射流受到的电场力就会很大，就会使针尖处的溶液供应速率无法达到供给要求，就会出现断流，这样形成的纤维，直径分散度会比较大。

　　因此，实验中，对于某一种纺丝液，正常纺丝需要的场强是一个区间范围，即所加电压有一个区间范围。取实验组A9、A10、A11，这三组试验中SF/PVA=100/0，SF浓度为34%，除纺丝电压变化外，其余条件均相同。

　　根据实验数据可分析出A9中纤维相对较粗，纤维直径分布比较宽，纤维粗细不均匀，其原因是喷丝液挤出后没有得到充分的牵伸。随着电压的增高，电压为25kV时纺丝液得到很好的牵伸，纤维直径变细，直径分布比较窄。电压为30kV，纤维直径的标准差和变异系数均比电压为25kV时小，说明此时纤维直径更加均匀。